Mantar Tanı Testi

Mantarlar,(funguslar) doğada yaygın olarak bulunmaktadır. Bugüne kadar yaklaşık olarak 400.000 tür tanımlanmış olmakla birlikte bunlardan sadece 100-150 tanesi insanlarda enfeksiyon oluşturabilmektedir. Mantarlarla meydana gelen hastalıklara mikoz adı verilmektedir. Mantarları ve mantar hastalıklarını inceleyen bilim dalı ise mikoloji olarak adlandırılmaktadır.

Mantarlar, ökaryot yapısında olan mikroorganizmalardır. Klorofil içermedikleri için fotosentez yapamazlar ve bu özellikleri ile bitkilerden ayrılırlar. Fakültatif anaerob ya da zorunlu aeropturlar. Mantarlar heterofilik mikroorganizmalardır yani karbon ve enerji kaynağı olarak organik bileşikleri kullanırlar. Hidrolitik enzimlerini dış ortama salarak besinleri sindirirler ve sindirilmiş besin maddelerini absorbsiyon yoluyla hücre içine alırlar.

Bazı mantarlarda kapsül bulunur ve polisakkarit yapısındadır. Kapsül polisakkaridi glukuronoksilomannan, galaktoksilomannan ve mannoprotein olmak üzere en az üç farklı polimerden meydana gelir. Mantarlarda hücre duvarının % 90‘ı kitin, glukan, manan, kitosan gibi polisakkarit polimerlerinden, % 10’u protein, glikoproteinler ve lipidlerden oluşur. Polisakkaritlerin türü ve miktarı mantar türüne göre değişir. Hücre duvarı hücreye şeklini verir, osmatik şoktan korur, antijeniktir ve bazı enzimleri içermeleri nedeniyle de fizyolojik bir aktiviteye sahiptir. Hücre membranı, memeli membranlarına benzer şekilde fosfolipid, protein ve sterollerden oluşan iki tabakalı bir yapıdır. Memeli zarından farklı olarak kolesterol yerine ergosterol ve zimosterol bulunur. Hücre membranının görevleri arasında sitoplazmayı korumak, madde alışverişini düzenlemek ve kapsül ile duvar sentezine yardım etmek yer alır. Günümüzde tadavi amaçlı kullanılan antifungal grubu ilaçların büyük bir bölümünün hedef bölgesi membranda yer alan ergosteroldür.

Mantar sporları üremeden sorumludur. Üreme eşeyli sporlar (zigospor, askospor, basidyospor), eşeysiz sporlar ( blastospor, artrospor, klamidospor, makrokonidium, mikrokonidium, sporangiospor) yada paraseksüel yol ile olur. Mantarların bilimsel sınıflandırılması eşeyli sporlara göre yapılır. Morfolojik görünümlerine göre; mayalar (Candida, Saccharomyces, vs. ) ve küfler (Ascomycetes, Zygomycetes, Deuteromycetes, vs) olmak üzere ikiye ayrılır.

Tanı Testleri

Çok çeşitli olan mantarların izolasyon ve idantifikasyonları kültür temelli, kültüre dayalı olmayan (serolojik, moleküler) yöntemler uygulanarak yapılır. Klinik örnekler antifungal tedavi başlamadan önce, aseptik koşullarda toplanmalı, formol içine konulmamalı ve steril kaplarla materyal için en uygun olan taşıyıcı besiyeri ile laboratuara ulaştırılmalıdır.

Kültür sonuçlarının uzun sürede sonuçlanması nedeni ile direk mikroskobik değerlendirme büyük önem taşımaktadır. Laboratuara gönderilen klinik örnekler öncelikle makroskobik olarak değerlendirilir, mikroskobik değerlendirmede maya ya da küf varlığı açısından ilk bilgiler edinilir. Direk mikroskobik incelemede % 10-20-30 arası genel olarak %30 oranında KOH kullanılır. Deri ve tırnak kazıntısı, tüy, kıl, yün, deri parçası, vs. alınan materyallere kitin tabakasının çözülmesi ve mantar hiflerinin ortaya çıkması için KOH eklenir. Boyalı mikroskobik inceleme için gram boya, laktofenol pamuk mavisi, kalkoflor beyazı, çini mürekkebi, Grocott-Gomori matamin gümüşleme, priyodik asid-Schiff (PAS), Giemsa, Wright ve Mason-Fontana gibi boyalar kullanılır. Ayrıca enfekte yüzeyde mantar aramada Wood ışığıda kullanılabilir. Nikel oksitli bir filtreden geçen ultraviyole A ışınıdır. Bu ışık altında bazı mantarlar soluk sarı, yeşil, sarı floresan, ile mercan kırmızısı floresan gibi renkler vererek tanımlanabilirler.

Kültür direkt mikroskobiden daha spesifik bir tanı yöntemidir. Kesin tanı koyulmadığında veya mantarların cinsini saptamak için uygulanır. Kültür değerlendirmede kolonilerin morfolojisi, oluşan pigment rengi tanımlamada öncelik oluşturur. Kullanılan besiyerleri, alınan klinik örneğe göre değişir. Kültür besiyerleri primer izolasyon amaçlılar ve spesifik amaçlılar olarak ayrılır.

Primer izolasyon amaçlılar;

- Sabauraud-dekstroz-agar (SDA) ve Beyin kalp infüzyon agarı(BHI); Saprofit ve patojen mantarların primer izolasyonunda kullanılır. Steril olmayan ortamdan alınan örnekler için ise antibiyotikli SDA ve BHI kullanılır. Oda sıcaklığında ve 37°C’ de 1-4 haftada üreyip genellikle kirli-beyaz veya krem rengi, yumuşak kıvamlı ve tipik olarak mayamsı, kokulu koloniler yaparlar.

-İnhibitör mold agar ve Maya özütü fosfat agar; patojen mantarların primer izolasyonu.

Spesifik amaçlılar;

-Tween 80 ve tripan mavili mısır unlu jeloz(MUJ); Candida albicans ın klamidospor tanısı,

-Pamuk tohumu dönüşümü agarı ; Blastomyces dermatitidis in küf fazından maya fazına dönüşümü,

-Czapek’s agar; Aspergillus izolasyonu,

Kuş tohumu agarı (Staib agar); Cryptococcus neoformas izolasyonu,

-CHROMagar Candida; Candida türlerinin enzimatik reaksiyon oluşumu temeline dayanan izolasyonu,

-Maya fermentasyon buyyonu; Mayaların fermentasyon özellikleri,

-Maya nitrojen agarı; Mayaların karbonhidrat asimilasyon özellikleri.

Bunlara ek olarak BACTEC ve BacT/Alert metodları, kan kültürlerinde mantarların tespitini hızlandırmaktadır.

Germ-Tüp Testi; bu testte hücrelerden germ tüpü oluşumu aranır. Maya benzeri mikroorganizmalardan 0.5-1.0 ml steril serum içinde hafif bir süspansiyon yapılır ve 37°C de 2-4 saat inkübe edilir. Karışımdan bir damla lama konur ve üzeri lamelle kapatılır. Mikroskop altında hücrelerden germ tüpünün meydana gelip gelmediği araştırılır. C. albicans ' ta bu durum karakteristiktir.

Serumda veya vücut sıvılarında mantar antijenlerinin veya metabolitlerinin aranmasına yönelik testler sistemik mantar infeksiyonlarının serolojik tanısı için daha değerlidirler. Antikorlar, lateks aglutinasyon (LA), ELISA, Enzyme Immuno Assay (EIA) ,Radioimmuno Assay (RIA), immunelektroforez (IE) ve immunodiffuzyon (ID) yöntemleri ile saptanabilir. Bu yöntemlerle hücre yapısındaki veya metabolitlerindeki antijenlerden; mannan, D-arabinitol, (1-3)-β-glukan, polisakkarit glukoroksilomannan, galaktomannan ve enolaz tespit edilebilir.

Moleküler tanı yöntemleri giderek popüler olmakla birlikte her klinik laboratuarda rutin bir yöntem olarak uygulanması ekonomik nedenler ve standardizasyonunun sağlanamaması nedeni ile yaygın değildir. Enfeksiyon etkeni mantarların saptanması ve tanımlanmasında nükleik asit amplifikasyon ve hibridizasyon problarının kullanıldığı sinyal amplifikasyon yöntemlerinden yararlanılır. Nükleik asit amplifikasyon teknolojilerinde polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) veya benzeri yöntemler kullanılır. Mantar yükünün çok az olduğu, kültür ve serolojik tanının henüz yetersiz olduğu evrede PCR temelli tanı yöntemlerinin çok daha etkin olacağı söylenebilir. Reverstranskriptaz (RT) PCR'da hedef RNA'nın çoğaltılması amaçlanmıştır.